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高级别宫颈鳞状上皮内瘤变锥切手术前后阴道菌群比较研究

作者:康玲,马啸
中国实用妇科与产科杂志 2018-1-10 阅读 字号:T|T

宫颈癌的癌前病变是宫颈上皮内瘤变(CIN),而高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)的持续感染被认为是CIN进展为宫颈癌的重要因素。虽然在性生活活跃的女性中HPV感染较常见,但超过90%的HPV感染或感染所致的病灶呈一过性,可以自然消退,只有一小部分感染HPV的女性最终会发生CIN,并且未经治疗后进展为癌。因此,虽然HPV感染在CIN的发生发展中发挥着重要的作用,但单独HPV感染不足以致癌,可能存在其他因素协同疾病的发生发展。近年来,阴道微生态环境的变化在HR-HPV持续感染过程中是否发挥作用也开始被人们所关注。高级别宫颈鳞状上皮内瘤变(HSIL)包括CIN2和CIN3,其作为宫颈癌前病变的终末阶段,对宫颈癌的防治有着重要意义。目前国内关于阴道微生态与宫颈癌前病变的研究鲜有报道。本研究在HSIL患者锥切手术前后对阴道菌群进行两次取样,同时检测高危型HPV-DNA含量,通过Illumina高通量测序技术以及BIPES(BarcodedPaired-End IlluminaSequencing)生物信息分析方法比较两者的阴道菌群结构信息,以了解阴道微生态与HR-HPV感染之间的相关性。


1、资料与方法  


1.1  研究对象  选择2015年12月至2016年8月于南方医科大学珠江医院妇产科、广东省人民医院妇产科诊治的HSIL患者共20例。年龄(42.25±1.21)岁,均处于育龄期。根据患者治疗前后分为两组:术前组(pre.H):患者仅行阴道镜活检确诊为HSIL,未做其他任何处理;术后组(post.H):同一患者在确诊后已行宫腔镜下宫颈锥切术。患者均签署知情同意书。


1.1.1  纳入标准  术前活检病理结果明确为高级别宫颈鳞状上皮内瘤变,且在活检前已行第2代杂交捕获技术(HC2)检测高危型HPV-DNA含量;育龄期女性月经周期规则;性生活史不少于3年;3 d内无性生活史、阴道用药史;48 h内无阴道灌洗及1个月内无使用抗生素或免疫抑制剂等药物史;入院后均由同一主任医师行宫腔镜下宫颈锥切术,术后病理提示没有升级到浸润癌,且切缘阴性。


1.1.2  排除标准  (1)月经期、产褥期、妊娠期、绝经期及围绝经期妇女。(2)全身系统性疾病(如糖尿病)、激素治疗性疾病(如急慢性肾炎)等。(3)伴有阴道炎相关症状。


1.2  材料和方法


1.2.1  主要试剂   阴道拭子基因组DNA提取试剂盒(北京百泰克公司,中国)、蛋白酶K(Sigma公司)、Ex-taq PCR试剂盒(宝生物公司)。


1.2.2  标本采集


1.2.2.1  取样时间  对同一患者均进行两次取样。第1次取样时间为该患者经阴道镜活检确诊为HSIL,且于活检前已检测高危型HPV-DNA含量,之后未做其他任何处理时于卵泡期采集样品,分别标记为pre.H1、pre.H2、pre.H3......pre.H20;第2次取样时间为同一患者在进行手术治疗后的第3个月经周期的同一时间点(卵泡期)取样,同时复查高危型HPV-DNA含量,对应样品标记为post.H1、post.H2、post.H3......post.H20。


1.2.2.2  取样方法  嘱研究对象排空膀胱后平躺于妇检床上取截石位,两腿分开,尽量暴露生殖器及会阴部。以无菌窥阴器撑开阴道,充分暴露宫颈,用无菌阴道棉拭子于阴道穹窿或阴道中段侧壁留取分泌物,至少旋转10~15s,待拭子充分吸收分泌物后小心放入干燥无菌试管中,避免接触阴道口及外阴,防止标本污染,然后转移至-80℃低温冰箱保存。在所有样品收集完成后转移至南方医科大学珠江医院检验医学部实验室进行细菌总DNA提取。


1.2.3  细菌总DNA提取与检测  以细菌基因组DNA提取试剂盒提取样本中总DNA,具体操作步骤参照说明书。提取的总DNA经紫外分光光度计(波长为570 nm)测定纯度和浓度,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后放置4℃冰箱中保存备用。


1.2.4  16s rRNA V4 区基因片段的扩增及Illumina测序  以样本总DNA为模版,采用引物514F和805R,合成单位:上海生工生物工程股份有限公司。514F:GTGCCAGCMGCCGCGGTAA、805R:GGACTACHVGGGTWTCTAAT,扩增其中的16s rRNA V4区基因。PCR反应体系(25 μL):10×buffer(2.5 μL),dNTP(2 μL),Mg2+(1.5 μL),P1(0.5 μL),P2(0.5 μL),Ex-taq(0.25 μL)模板DNA(1μL),H2O(16.75 μL)。PCR扩增条件:94℃预变性2 min,然后94℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸30 s,共30个循环,72℃最终延伸5 min。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳(电压180V,电泳时间20 min)检测产量和特性。最终产物使用Qiagen QIAquick GelExtraction Kit切胶回收纯化后,送深圳华大基因公司通过Illmnina HiSeq2000平台进行双末端100bp测序。


1.3  生物信息学分析  所测得的序列经过BIPES操作进行初步处理,保留有效测序数据进行修剪;反向互补组装V4序列;釆用二阶段聚类算法(TSC)进行聚类,提取出每个操作分类单元(OTU)的代表序列后,采用全局比对序列分类(GGAST)算法对OTU进行分类。利用GAST进行物种的分类,其中属于乳酸菌属的OTU利用Blast程序进一步分到细菌种级别,再进行菌群结构分析、A1pha多样性以及β-多样性分析。基于Unifrac距离,采用QIIME进行主成分分析。


1.4  统计学处理  应用SPSS20.0统计软件进行统计分析,两组计量资料间的比较采用两配对样本的非参数检验,对多样性指数应用Wilcoxon Signed Ranks检验。P<0.05为差异有统计学意义。


2、结果


2.1  HC2结果  本研究所纳入的20例HSIL患者手术前高危型HPV-DNA均为阳性,手术后3个月第1次复查均转阴性。见表1。


2.2  测序信息  本实验送测序样品数40个,总共获得404 671条16S rRNA基因序列,序列数最低为1725条,最高为25 339条,将测序深度标化到1000条,所有样品均可纳入分析。平均每个样品10 117条序列。


2.3  Alpha多样性分析  Shannon指数同时受到物种丰富度和均匀度两者的影响,数据分析显示HSIL患者术前与术后的Shannon指数分别为1.845和2.422(图1a),术后组高于术前组,差异有统计学意义(P<0.05)。< p="">



2.4  β-多样性分析  根据QIIME 分析流程进行β-多样性分析,用UniFrac距离进行的PCoA分析来展示两组菌群之间的相似度。每个点代表—个样品,而点与点之间的距离通过两个菌群之间的序列相似度比较获得。如图1b所示,HSIL患者术前菌群结构(蓝色)和术后菌群结构(红色)能大致分开,表明二者的菌群结构有所区别。


2.5  菌群结构分析  分别对每例患者术前的阴道菌群结构进行属水平构成比分析。通过图2可以看出,HSIL患者菌属构成主要可分为以下3类:(1)以惰性乳酸杆菌(L.iners)为绝对优势菌属,比如H3、H4、H6、H7、H9、H14、H19。其阴道微生态主要以L.iners为主要优势菌属,其他菌属含量明显减少。除了H9、H19所含卷曲乳酸杆菌(L.crispatus)含量稍高,分别为15.20%、35.30%之外,其他患者L.crispatus含量明显降低,最低仅占0.1%。(2)以加德纳菌属(Gardnerella)为主要优势菌属,比如H1、H2、H5、H11、H13、H17患者。其阴道微生态主要以Gardnerella为主要优势菌属,L.iners、L.crispatus含量均较低甚至缺如,其他菌属含量亦明显减少。(3)以L.iners以及细菌性阴道病(BV)相关致病菌(Gardnerella、Prevotella)为优势菌属,如H8、H10、H12、H15、H16、H18、H20患者。其阴道微生态主要以L.iners、Gardnerella、Prevotella等为主要优势菌属,同时奇异菌属(Atopobium)亦占有一定比例,如H8、H12、H16,分别为29.90%、20.80%、20.10%,但L.crispatus含量均较低甚至缺如。


HSIL患者经过锥切手术后阴道微生态的变化情况如图3、表2所示。


L.iners以及Gardnerella、Prevotella等BV相关致病菌均有不同程度降低,其中Gardnerella以及L.iners的降幅较大,分别为29.13%以及17.92%。而L.crispatus以及其他菌属均有不同程度的增长,其中L.crispatus的涨幅为27.71%。术后以L.crispatus、Ureaplasma、Prevotella、Enterococcus等为优势菌属。

3、讨论


本研究发现HSIL患者阴道菌群有多种表现型,包括以L.iners为优势菌属、以Gardnerella为优势菌属以及以L.iners和BV相关致病菌(Gardnerella、Prevotella)共同为优势菌属3种类型,而L.crispatus含量均有明显减少。目前普遍认为,产过氧化氢(H2O2)的乳酸杆菌是健康女性阴道菌群中的优势菌属,因为其所产生的H2O2和细菌素类物质可以抑制其他多种病原体的生长。而目前对L.iners的体外研究提示其产酸能力较弱,仅有约9%的菌株可以产生H2O2,而L.crispatus以及詹氏乳酸杆菌(L.jensenii)等菌种却可产生大量H2O2。另外有学者通过体外实验也发现L.crispatus可以抑制宫颈癌细胞的增殖,并且可以诱导凋亡。2015年国外学者Mitra等通过比较健康人、CIN以及宫颈癌患者的阴道微生态发现,随着疾病严重程度的增加,L.crispatus菌属逐渐减少,表明L.crispatus菌属可能可以对癌前病变和癌变的发展起到抑制作用。


本研究亦发现,有部分患者是以BV相关致病菌,如Gardnerella、Prevotella等为主要优势菌属。2012年,一项荟萃分析证实了BV与CIN存在正相关关系。BV患者的阴道pH值升高,这可能会影响女性青春期后宫颈鳞状上皮的化生,从而使得转化区易受HPV的侵袭。此外,BV相关致病菌分解氨基酸后释放的胺类物质,特别是腐胺、尸胺以及三甲胺等物质可与亚硝酸盐结合形成亚硝胺。亚硝胺是强致癌物,能够诱导DNA突变引发不良事件。Gillet等指出BV患者的阴道分泌物中黏蛋白降解酶增加,这些酶通过毒力破坏黏膜屏障,提高HPV易感性,而BV发作时亚硝胺的积累可导致宫颈上皮细胞的转化,这可能与HPV协同致癌。另外,有学者研究发现,Gardnerella可释放溶细胞素,导致阴道上皮细胞死亡,从而减少乳酸杆菌的定植。有学者亦通过体外实验发现,Prevotella某些菌株可以侵袭人类宫颈上皮(Hela)细胞,导致局部炎症因子IL-6、IL-8的增高,但这是否会增强HR-HPV的致瘤作用尚不清楚,需要进一步的实验研究加以证实。


此外,本研究还发现部分HSIL患者的阴道菌群中Atopobium的构成比明显增加。Atopobium属于放线菌门,菌体呈短链棒状,严格厌氧,革兰染色阳性。其营养要求苛刻,并且生长缓慢,是依赖传统培养方法难以发现的菌种。随着测序技术的兴起,已有研究发现Atopobium与多数妇科疾病有关,比如BV、盆腔炎性疾病以及其他妇科感染性疾病。最新的研究提示Atopobium可能与子宫内膜癌也有相关性。亦有文献报道,大量的Atopobium可能会影响HPV的清除。Oh等通过比较CIN以及健康人的阴道微生态发现,L.crispatus减少,以Atopobium为优势菌,其次为Gardnerella和L.iners的微生态模式可以显著增加CIN的风险。Atopobium可以显著提高阴道或宫颈上皮细胞趋化因子的表达,包括IL-8、MIP-3α(CCL20)、RANTES(CCL5)以及促炎转化因子(NF-κB)、TNF-α等,从而导致慢性炎症。炎性状态可能会导致组织损伤,增加HPV病毒的致癌潜力。


本研究发现HSIL患者经宫颈锥切手术后,高危型HPV含量显著减少甚至消失,同时L.iners、Gardnerella、Prevotella、Atopobium等菌属均有不同程度减少,L.crispatus含量明显增加,术后以L.crispatus、Ureaplasma、Prevotella、Enterococcus等为优势菌属。据此推测,术前观察到的多种表现型实质为对机体具有保护作用的菌属减少;而治疗术后HPV含量减少,阴道菌群出现了向常见阴道优势菌属转变的趋势,L.crispatus等菌属增加。提示HPV感染与阴道菌群是存在相互影响的,但孰因孰果尚不清楚,及早改善微生态是否会有助于HPV的清除尚需进一步研究证实。


本研究的不足之处是纳入患者数量较少,随访时间较短,难以代表所有宫颈癌前病变患者宏基因组特征。后续可以针对CIN及宫颈癌患者的阴道菌群进行动态研究,寻找差异菌属及其差异基因或蛋白,从而进一步研究其发病机制。


综上所述,本研究表明高级别宫颈鳞状上皮内瘤变患者经手术去除病变后,高危型HPV含量显著减少甚至消失,其阴道菌群出现了向常见阴道优势菌属转变的趋势。提示HPV可能与阴道菌群构成密切相关且相互影响。(参考文献略)

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